后来，国内形势急剧变化，到了1915年，袁世凯为复辟帝制，准备接受日本提出的“二十一条”，全国人民愤然，革命形势日趋成熟。留在上海等地的革命党人催请陈其美回国主持讨袁斗争。孙中山这时正在加紧建立中华革命军，乃命陈其美回上海，招募革命队伍建立中华革命军东南军。尽管陈其美已是北京政府重金通缉的“国事犯”，境况艰险，但他抱了必死的决心毅然决定回国。
陈其美一行中没有蒋介石，临行前，蒋介石带着一种沉重的心情来送陈其美，陈其美似乎预感到此行凶多吉少，他紧紧地握着蒋介石的手，用那坚定而充满信心的目光注视着蒋介石，沉重地说：“吾愿决心，吾愿牺牲一己，以偿我党之代价，以挽我国之弱风。吾愿扫除中国之恶魔，吾愿建造世界之平等。”蒋介石更是心中充满感叹，他强打精神，鼓起勇气，用一种极其坚定而又深沉的语气向陈其美表示了自己的决心：此去万一不幸，而为袁贼所害，我一定要成为兄之化身。为革命赴汤蹈火，不惜牺牲自己的生命，以完成兄的未竟之志。
陈其美把一切抛在脑后，一到上海便摆出一种决战的气势开始行动起来。1915年10月27日，孙中山委陈其美为中华革命军淞沪司令长官，主持上海讨袁军事。他电召蒋介石、杨庶堪、丁人杰、余祥辉等人到上海，会同吴忠信、周淡游、邵元冲等人在法租界霞飞路（今淮海中路）筹组讨袁总机关，蒋介石被分派担任军事工作。
陈其美和蒋介石一致认为，根据辛亥革命和一次革命失败的教训，要在上海获得起义成功，首先要袭取停泊在黄浦江面的海军军舰，然后使用海军炮火，同地面兵力结合，协同攻取制造局。由于几个月来运动陆海军已取得相当成效，肇和舰舰长黄鸣球、舰员陈可钧等人均已倾向革命，他们认为机不可失。这时海军当局已觉察异样，欲将肇和舰在12月6日调往广州。陈其美获此消息后，便于5日发动肇和舰起义。
随着肇和舰的炮声一响，蒋介石随同陈其美亲临南市工程局督战。陆上各队伍在陈、蒋的指挥下，分头攻击警察局、电灯厂、电话局等预定目标。但是肇和舰上的起义人员并未及时组成陆战队向陆上增援。起义队伍曾攻占南市淞沪警察署，但只获少数枪支而无实弹，次日黎明即被袁军包围。袁军人多势众，装备精良，炮火猛烈，起义队伍虽然奋勇，终因寡不敌众而败下阵来。陈其美和蒋介石等人被迫回到渔阳里总部，隐蔽起来，形势异常危急。然而，就在当天夜晚，法租界的巡捕来到渔阳里搜查，多亏陈果夫机敏过人，大声叫嚷，弄出了声响，以引起众人的警觉。这样，陈其美等众人才得以逃脱，集合于新民里119号蒋介石的住处。他们原以为肇和舰已经得手，打算再到那儿去。第二天清早刚出门，便碰到了先前曾率30余人攻占了肇和舰的杨虎，才知道肇和舰在应瑞、通济两舰的轰击下死伤甚众，陈可钧被捕牺牲，杨虎逃了出来。
知道肇和舰起义失败的消息，大家心情都很沉重，在这种情况下，陈其美激励大家说：“以后局面开展，疾风密云，一矗千里，大局指顾可定，直意料中来”。他告诉大家蔡锷已在云南发动了护国战争，此时应以上海、广东、湖北三处为根据地，他说：“以此三者得其一，则可号召东南；三者得其二，则可风行全国；如三者尽得，则大局可底定矣”。
随着蔡锷领导的护国军节节胜利，孙中山于1916年4月27日从日本回国，到上海亲自主持讨袁斗争，发表《第二次讨袁宣言》，号召全国民众团结起来进行反袁斗争。他宣称：“袁氏未去，当与国民共任讨贼之事，袁贼既去，当与国共荷监督之责，决不肯使谋危民国者复生于国内。”孙中山此时，吸取了过去失败的惨痛教训，决意放弃中华革命党独占政权的政治路线，愿与各方合作讨袁，而以恢复《中华民国临时约法》为最低限度的要求。随着革命形势日益高涨，陈其美的压力更大，因为，陈其美已有几次起义的计划而因经费无着而告吹。他千方百计地寻找筹集经费的各种途径。当时袁世凯一直在用金钱诱惑陈其美脱离革命，曾汇款70万元至沪，派人贿赂陈出洋游历，为陈拒绝。这样，袁党分子视陈为眼中钉，欲置之死地而后快，便利用陈亟欲谋款的急切心情，设计了一个圈套。
由朱光明、许国霖、程子安等人假装开了一个鸿丰煤矿公司，勾结叛徒分子李海秋，李海秋则对陈其美声称，鸿丰公司有一块矿地，预备向日本人抵押一笔巨款。如果陈其美能从中介绍签约，就以借款的十分之四来资助革命。求款心切的陈其美，没有仔细考虑就同意了，约定5月18日下午带合同底稿来签字。到了那天，李海秋便带了许国霖等人来到萨坡赛路（今淡水路）14号陈的寓所。大家刚刚坐定，李海秋推说忘了带来合同底稿，要回去取。李一出门，就进来两个陌生人，拔枪向陈其美射击，陈其美防身不及，头部连中数弹，当场身亡。陈其美遇刺的消息一传出，在革命党中引起了强烈震动，但反映最为强烈的还要数蒋介石。
听到陈其美被刺的消息，蒋介石吃惊得一时讲不出话来，他急忙奔到现场，抱住陈其美的尸体失声痛哭，他悲痛至极。当时还是袁世凯统治的年月，许多人不敢公开露面，陈其美暴尸于此，令人惨不忍睹。但蒋介石毅然将陈的遗体转移到新民里119号自己的家里，然后用巨款购置了一具棺木，2日午后入棺成殓。他又怀着无比悲痛的心情，挥笔写下了祭文。文中说：“丁未至今，十载其间，所共者为何事，非安危同仗之国事乎？所约者为何辞，非生死与共之誓辞乎？而乃一死一生，国事如故，誓辞未践，死者成仁取义，固无愧于一生，而生者守信践约，岂忍惜于一死。”他表示：“大难方殷，元凶未戮，继死者之志，生者也；完珍者之业，生者也。生者未死，而死者犹生，死者之志未终，而生者终之，死者之业未成，而生者成之。不终不成不已。而不死亦不已，以履去春握别扶桑第二化身之谶语，以守我之信践我之约而已。”以此来表达他对陈其美的怀念之情以及继承遗志的决心。
然而，陈其美被害不到20天，袁世凯就亡命归天了。这样，武装反袁不战而捷。在陈其美殉难的第85天，革命党人在上海隆重举行了“陈英士暨癸丑以后殉义诸烈士追举大会”。在他殉难一周年之际，他的遗体由上海归葬故里湖州，孙中山、黄兴、章太炎等都写挽联哀悼，蒋介石写的挽联是：
天道无知，苦思公十年旧雨。
中原多故，乃坏汝万里长城。
陈其美死后，蒋介石一直把他们之间的这种真挚的感情埋藏于心，不仅于此，他还将这份感情转移到陈果夫、陈立夫身上，为的是以此来报答陈其美生前对他的知遇之恩。1927的蒋介石北伐到上海，专门举行一个“陈英士先生殉国十一周年纪念会”，蒋介石亲往主持。他在上海各界的欢迎会上，发表了一篇题为《纪念陈英士同志》的演说，他满怀激情地说：“我们追溯前源，我们的成功，也就是陈烈士遗留下来的”，“我们追溯国民党领导国民的成功，我们第一纪念总理，第二要纪念陈烈士，没有陈烈士就没有国民党”。他还说：“诸位今天来欢迎我，不是欢迎我，是欢迎陈烈士的化身。我希望大家都做陈烈士的化身。”
应当说，了解了这一点，我们就不难理解蒋介石与陈果夫、陈立夫之间开始为什么那么密切，以及为什么会形成蒋家天下陈家党的政治格局。
