便猜测光绪帝一定衔恨李连英。传说在慈禧患病时，李连英为保全自己，同慈禧合谋毒杀了光绪帝。慈禧御前女官德龄在《瀛台泣血记》里写道：万恶的李莲英眼看太后的寿命已经不久，自己的靠山快要发生问题了，便暗自着急起来。他想与其待光绪掌了权来和自己算账，不如还让自己先下手的好。经过了几度的筹思，他的毒计便决定了。总之，说李连英谋害光绪帝，只是人们的一种猜测。

第三个是崔玉贵。崔玉贵为慈禧御前的首领太监，也深得慈禧宠幸。八国联军攻入北京，慈禧在逃跑前，命崔玉贵将珍妃从软禁之地北三所提出来，然后扔到井里。珍妃是光绪帝之爱妃，而崔玉贵是杀害珍妃的刽子手。回銮后，慈禧为取悦西方列强，便着意改变自己的形象，放风说本不想杀害珍妃，而是崔玉贵误听懿旨，擅自所为，并将其逐出宫去。后来风声小了，又将崔玉贵召回宫中。崔玉贵自知，如果光绪帝亲政，他是庆亲王奕劻，逃不过一刀的。自然，他便成了杀害光绪帝的嫌疑犯之一。

第四个是奕劻。胡思敬在《国闻备乘》里记道：迨奕劻荐商部郎中力钧入宫，进利剂，遂泄泻不止。次日，钧再入视，上（光绪帝）怒目视之，不敢言。

钧惧，遂托疾不往。谓恐他日加以大逆之名，卖己以谢天下也。

据清西陵文物管理处负责人介绍，光绪帝坟墓(清西陵的崇陵)曾被打开，后来清理封闭，留下若干头发、遗骨和衣服等由该处妥善保存。为解开“光绪之死”这一历史谜案，从2003年开始，中央电视台、清西陵文物管理处、中国原子能科学研究院、北京市公安局法医检验鉴定中心等单位的领导和专家组成了“清光绪帝死因”专题研究课题组。同时，这一研究也被国家清史编篡委员会纳入《国家清史篡修工程重大学术问题研究专项课题》。

在不能开棺直验且时隔久远、检材条件很差等不利因素下，专家们历时五年，由光绪帝发砷入手，利用“中子活化”、“X射线荧光分析”“原子荧光光度”等一系列现代专业技术手段，通过开展对比、模拟实验、双向图例等工作，对清西陵文物管理处提供的光绪遗体的头发、遗骨、衣服以及墓内外环境样品进行了反复的检测、研究和缜密的分析。经科学测算，光绪的头发截段和衣物上含有剧毒的三氧化二砷即砒霜，而其腐败尸体仅沾染在部分衣物和头发上的砒霜总量就已高达约201毫克。

由国家清史编纂委员会主任戴逸教授等13位专家联合撰写的《清光绪帝死因研究工作报告》称，根据相关研究，常人口服砒霜60至200毫克就会中毒身亡。光绪帝摄入体内的砒霜总量明显大于致死量。其胃腹部衣物上的砷是其含毒尸体腐败后直接侵蚀遗留所致，而其衣领部位及头发上的大量砷，则由其腐败尸体溢流侵蚀所致。

编辑钟里满则以光绪帝临终前参与诊治的医生亲笔回忆录及搜集到的军机大臣的日记等为依据，进一步确定了光绪帝属急性胃肠性砒霜中毒而亡这一结论。
光绪死因的确证，是运用现代科学技术和侦察思维解决历史疑难问题的成功尝试，是自然科学与社会科学研究并肩合作的范例，开辟了学术文化研究的新路径。